在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加酶結(jié)合物和顯色劑后?？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)，有人稱之為孵育。

溫育的時間選擇

溫育這一步是ELISA測定中容易出現(xiàn)問題的步驟。目前國內(nèi)ELISA試劑盒的反應(yīng)溫育時間為37℃ 30分鐘-1小時，進口ELISA試劑盒則通常為37℃ 1-2小時才能有較*的結(jié)合，低于1小時，可能會影響測定下限。

ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機會，只有貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴散才能達(dá)到反應(yīng)的終點。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時間的溫育。

溫育所需時間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時間相對較短。

溫育的溫度選擇

溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。

在建立ELISA方法作反應(yīng)動力學(xué)研究時，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時，產(chǎn)物的生成可達(dá)。為加速反應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜采用更高的溫度。抗原抗體反應(yīng)4℃更為*，在放射免疫測定中多使反應(yīng)在冰箱中過夜，以形成多的沉淀。但因所需時間太長，在ELISA中一般不予采用。

溫育的方式選擇

溫育方式常采用溫箱法、微波輻射法和水浴法。其中水浴法能較好解決因受熱不均衡所致的周圍孔與中央孔結(jié)果的吸光度差異（“邊緣效應(yīng)”即外周孔顯色較中心孔深）。可將ELISA板置于水浴箱中，板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速平衡，為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。

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若用溫箱，ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料（如金屬等），在盒底墊濕的紗布，后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應(yīng)如此。為避免酶標(biāo)板底部受水汽或磨損導(dǎo)致的讀數(shù)誤差，一般采用鼓風(fēng)恒溫箱保溫，這個過程必須在酶標(biāo)板上方貼封紙，以免蒸發(fā)。

無論是水浴還是濕盒溫育，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應(yīng)，操作時的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時可根據(jù)說明書的要求控制溫育。

室溫溫育時，ELISA板只要平置于操作臺上即可。應(yīng)注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證時間精確，一個人一次不宜多于兩塊板同時操作、測定。

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關(guān)于溫育，在實際測定操作中應(yīng)注意

不同的溫育環(huán)境對檢測結(jié)果有影響，操作中應(yīng)嚴(yán)格按照說明書控制溫育時間及溫度，并注意封閉避免邊緣效應(yīng)。

為確保各板溫度都能迅速達(dá)到平衡，不可將反應(yīng)板疊加放置，設(shè)定的溫度及時間嚴(yán)格按照說明書進行，一般加入待測標(biāo)本后使其與固相抗原(抗體)置于37℃環(huán)境下溫育。因為很多恒溫箱的構(gòu)造，溫度及檢測的溫度并非酶標(biāo)板溫育溫度，所以使用恒溫箱溫育時建議將溫度計置于酶標(biāo)板旁，保證酶標(biāo)板旁溫度為37℃。

干育和水溫的影響差異較為明顯，建議使用水溫，注意將固相板放入水中，防止受熱不均勻。

試劑盒一般設(shè)定的反響溫度為 37℃，在這個溫度下放置 30 分鐘，蒸騰的水分會許多，對于全部反響體系來講，各種反響物的濃度會不斷添加，這么必會致使反響畢竟的值添加，溫育時貼封片或加蓋，避免標(biāo)本或稀釋液蒸發(fā)，吸附于孔壁。

試劑盒斷定的一定溫度下的反響時間并不是反響的完畢，添加反響的溫度，會加速反響，一樣添加時間會延伸反響，這么得到的反響程度會比試劑盒斷定的反響程度多，也會引起陰性高值或假陽性。

實驗操作的嚴(yán)謹(jǐn)性與實驗操作規(guī)范密不可分，未使用的試劑應(yīng)儲存于2-8℃，使用時應(yīng)回溫到室溫（20-25℃）。切忌不同批次的試劑混合使用，要經(jīng)常檢查酶標(biāo)儀和微量移液器的精度和準(zhǔn)備度……  ELISA看起來很簡單，但是在實際操作過程中，絕不能掉以輕心，除了嚴(yán)謹(jǐn)規(guī)范的實驗操作，高品質(zhì)的試劑盒與專業(yè)的技術(shù)團隊也是獲得準(zhǔn)確結(jié)果的保證！