人胰島素(INS)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒使用說明書
實驗原理 ：
本試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA) 。往預(yù)先包被有人胰島素(INS) 捕獲抗體的微孔中， 依次加入樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記的檢測抗體，HRP 酶結(jié)合物，中間經(jīng)過溫育和洗滌，用底物 TMB 顯色，TMB 在過氧化物酶(HRP)的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人胰島素 (INS) 呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長下測定吸光度 (OD 值) ，計算樣品濃度。
操作步驟 ：
1. 從室溫平衡 10 分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2. 加樣：分別將樣品或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品按照 100 μ l 每孔加入相應(yīng)孔中，空白孔加入 100μL 通用稀釋液。蓋 上封板膜后 37℃溫育 1 小時。 (建議：將待測樣本用通用稀釋液稀釋 1 倍后再加入酶標(biāo)板內(nèi)測試。從 而減少基質(zhì)效應(yīng)對測試結(jié)果的誤差影響，最后計算樣本濃度時需乘以對應(yīng)的稀釋倍數(shù)。所有的待測樣本和 標(biāo)準(zhǔn)品在檢測中建議設(shè)立復(fù)孔) 。
3. 加生物素化抗體：取出酶標(biāo)板，棄去液體，不用洗滌。每孔直接加入生物素化抗體工作液 100 μL，蓋上封 板膜后 37℃溫育 1 小時。
4. 洗板：棄去液體，每孔加入 300 μL 1x 洗滌液，靜置 1 分鐘，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板
3 次 (也可用洗板機洗板) 。
5. 加酶結(jié)合物工作液：每孔加入酶結(jié)合物工作液 100 μL，蓋上封板膜后 37℃溫育 30 分鐘。
6. 洗板：棄去液體按步驟 4 洗滌方法，洗板 5 次。
7. 加底物：每孔加入底物(TMB)90 μL，蓋上封板膜，37℃避光溫育 15 分鐘。
8. 加終止液：取出酶標(biāo)板，每孔直接加入終止液 50 μL，立即在 450nm 波長處測定各孔的OD 值。
結(jié)果判斷：
1. 計算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本復(fù)孔的平均 OD 值并減去空白孔的OD 值作為校正值。以濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)， 在雙對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(作圖時去掉空白組的值)。
2. 若樣品OD 值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
典型數(shù)據(jù)和參考曲線：
以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實驗者需根據(jù)自己的實驗建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
濃度 (ng/mL) | 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.625 | 0.312 | 0. 156 | 0 |
OD 值 | 2.22 | 1.56 | 0.92 | 0.63 | 0.42 | 0.25 | 0. 18 | 0.08 |
 校正 OD 值
| 2. 14 | 1.48 | 0.94 | 0.55 | 0.34 | 0. 17 | 0.1 | - |
試劑盒性能 ：
1. 重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于 10%，板間變異系數(shù)小于 10%。
2. 回收率：在選取的健康人血清、血漿和組織勻漿中加入 3 個不同濃度水平的人 INS，計算回收率
樣本類型 | 范圍 | 平均回收率 |
血清 (n=8) | 84- 101 | 96 |
血漿(n=8) | 92- 105 | 102 |
細胞培養(yǎng)上清(n=8) | 96- 108 | 105 |
3. 線性稀釋：分別在選取的 4 份健康人血清、血漿和組織勻漿中加入高濃度人 INS，在標(biāo)準(zhǔn)曲線動力學(xué)范圍
內(nèi)進行稀釋，評估線性。評估線性。
本試劑盒只能用于科學(xué)研究，不得用于醫(yī)學(xué)診斷 6
稀釋比例 | 回收率 (%) | 血清 | 血漿 | 細 胞 培養(yǎng) 上 清 |
1 ：2 | 范圍 (%) | 84-95 | 88-96 | 90- 110 |
平均回收率 (%) | 91 | 93 | 96 |
1 ：4 | 范圍 (%) | 89- 103 | 87- 108 | 105- 115 |
平均回收率 (%) | 94 | 98 | 108 |
注意事項：
1. 嚴(yán)格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達到室溫 20-25℃ 。使用
后立即冷藏保存試劑。
2. 洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。
3. 消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD 值。
4. 底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍的底物液不能使用。
5. 避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯誤結(jié)果。
6. 在儲存和溫育時避免強光直接照射。
7. 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
8. 任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應(yīng)試劑
的生物活性。
9. 不能使用過期產(chǎn)品。
10. 如果可能傳播疾病，所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。
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更新時間：2023-03-29 
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